Массовое выращивание клеток в культуре является центральным звеном любого технологического процесса, основанного на использовании клеток животных, и, в первую очередь, производства вирусных препаратов. Эта стадия определяет массу и качество клеток и, тем самым, в целом технологию получения вирусного сырья. Выбор способа культивирования вируса в значительной мере определяется способностью клеток размножаться на поверхности плотного субстрата или в суспензионной культуре. Трудно определить верхние и нижние границы крупномасштабного или промышленного выращивания вирусов в клеточных культурах. Все зависит от масштабов производства вирусных препаратов. В одних случаях речь идет о получении сотен литров, в других — десятков и даже сотен тысяч литров культурального вируса в год. Это зависит от вида вакцин и масштабов их применения. Изготовление живых вакцин при прочих равных условиях всегда требует меньших объемов вирусного сырья, нежели приготовление инактивированных, в особенности концентрированных вакцин.
Отсутствие эффективных вакцин для профилактики некоторых заболеваний объясняется, прежде всего, отсутствием экономичного способа получения им- муногенного материала в достаточном количестве.
В отличие от инактивированных вакцин против ящура и полиомиелита, выпускаемых в больших количествах, при многих заболеваниях человека и животных применяют живые вакцины, для изготовления которых не требуется большого количества вирусного сырья. Это, прежде всего, относится к тем вакцинам, которые перед применением разводят. Ежегодно производство таких вакцин, связанное с получением сотен литров культурального вируса, удовлетворяется использованием статических или вращающихся культуральных сосудов. Однако такие методы культивирования вирусов не могут удовлетворить крупномасштабное производство ряда вирусных вакцин. Например, при изготовлении противо- ящурной вакцины перевиваемые клетки выращивают в суспензии в реакторах с рабочим объемом более 1000 л. Крупные научно-производственные центры
Южной Америки ежегодно вырабатывали до 600 млн. доз моновалентной инактивированной противоящурной вакцины [1114]. Для этой цели необходимо еженедельно получать около 20 ООО л суспензионной культуры клеток ВНК-21.
До недавнего времени производство большинства вирусных препаратов основывалось на использовании первичных культур клеток из нормальных тканей различных видов домашних и лабораторных животных. Кроме того, в качестве клеточных субстратов для производства вакцин, применяемых в медицине, использовали немногие линии диплоидных клеток с ограниченной жизненной потенцией. Широкое применение таких препаратов в медицине и ветеринарной практике дало возможность достичь больших успехов в борьбе со многими опасными вирусными болезнями человека и животных. Однако первичные культуры клеток во многих отношениях не являются перспективными клеточными субстратами. Их приготовление связано с периодическим убоем животных и необходимостью выделения клеток из тканей.
Первичные культуры отличаются нестандартностью, таят в себе опасность в отношении эндогенной контаминации различными вирусами и микроорганизмами. Наконец, их сложно выращивать в условиях крупносерийного производства. Отмеченные трудности значительно возрастают в связи с тенденцией постоянного увеличения масштабов изготовления противовирусных препаратов. Кроме того, в последнее время все более широкое развитие получает разработка концентрированных и субъединичных вакцин, при изготовлении которых требуется большое количество вирусного материала. Естественно, что стоящая задача может быть решена лишь путем использования постоянных (перевиваемых) линий клеток, отличающихся способностью к бесконечной пересеваемо- сти вне организма, высокой стандартностью, низкой стоимостью, относительной простотой трансфекции рекомбинантной ДНК и последующего клонирования высокоэффективных продуцентов, высокой вероятностью правильного посттрансляционного процессинга вновь синтезируемых белков, кодируемых трансфецирующей ДНК. Ветеринарная наука в течение последней четверти века накопила большой опыт в изготовлении вирусных вакцин с использованием в качестве субстрата для размножения вирусов культур постоянных линий клеток животных. Особый успех достигнут в изготовлении инактивированной противоящурной вакцины. Производство вакцин против ящура имеет наиболее цитируемую технологию. Она основана на использовании линии трансформированных клеток новорожденного хомяка, выращиваемых в суспензии. Эта технология достаточно экономична, ее выполняют в биореакторах большой емкости [1114]. Накоплены определенные доказательства безопасности некоторых постоянных клеточных линий, используемых в качестве субстрата в производстве ряда биологических препаратов. Например, инактивированную противо- ящурную вакцину готовят из вируса, выращенного в культуре постоянной линии клеток почки новорожденного хомяка (линия ВНК-21). Более чем за 20- летний период этой вакциной привито свыше 100 млн. голов крупного рогатого скота и не обнаружено каких-либо нарушений у привитых животных, по край
ней мере, в течение 2—4 лет после введения вакцины. Имеется много других примеров безопасности применения инактивированных и даже живых вакцин против ряда болезней животных, приготовленных из вирусов, размноженных в культурах различных постоянных линий клеток. Применение биологических препаратов, полученных на основе перевиваемых клеточных линий, в медицине началось намного позже, чем в ветеринарной практике. Несмотря на очевидные преимущества постоянных линий клеток, медицинская практика до недавнего времени воздерживалась от их применения в производстве вирусных вакцин [102]. Причина заключалась в том, что, согласно существовавшему мнению, для изготовления медицинских вирусных вакцин можно было использовать клетки из тканей только клинически здоровых животных. Производство таких вакцин ограничивалось использованием первичных и диплоидных культур клеток. В диплоидных линиях клеток человека никогда не были обнаружены латентные вирусы или спонтанная трансформация клеток. Основное возражение против использования постоянных клеточных линий для репликации вирусов и векторных рекомбинатов в производстве вирусных вакцин медицинского назначения заключалось в их возможной онкогенности [48] из-за контаминации вакцин клеточной ДНК или генными продуктами (регуляторными белками). Интеграция гетерогенной ДНК может привести к предзлокачествен- ным изменениям в результате активации протоонкогенов, запуску онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии. В процессе репродукции вакцинных штаммов для живых вакцин с использованием клеточных линий, латентно кон- таминированных другими вирусами, могут появляться вирусные гибриды с неожиданными свойствами [1721].
Этот вопрос рассматривался неоднократно на различных научных форумах в Европе и Северной Америке. Ценность постоянных клеточных линий в качестве субстратов стала особенно очевидной благодаря успехам, достигнутым в последнее время в области фундаментальных биологических исследований, а также в связи с перспективой их использования в рекомбинантной ДНК-техноло- гии и получении генно-инженерных биопрепаратов. Общая тенденция к применению постоянных клеточных линий в производстве медицинских иммунобиологических препаратов наметилась на рубеже 70—80-х годов. Так, в 1978 г. в Лейк-Плесиде (США) было предложено использовать лимфобластоидные клетки человека для крупномасштабного производства альфа-интерферона. В 1981 г. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов одобрил применение неопухолевых и неконтаминированных вирусами постоянных клеточных линий для производства инактивированной полиомиелитной вакцины, а затем также для инактивированной вакцины против бешенства. Такое решение дало возможность в короткий срок разработать методы крупномасштабного выращивания вирусов с использованием микроносителей и создать высокоэффективные вирусные вакцины.
В истории создания биологических препаратов ключевая роль всегда принадлежала выбору приемлемо безопасных вариантов. Решение о применении
людям биопрепаратов, полученных с использованием постоянных клеточных линий, основывалось на оценке различными комитетами выгод и риска, связанных с созданием новых препаратов, по сравнению с существующими. Важнейшие потенциальные факторы риска, связанные с биологическими препаратами, производимыми на постоянных клеточных линиях, можно разделить на три категории: примесь гетерогенной ДНК, вирусы и трансформирующие белки.
Одним из основных вопросов, требующих самого пристального внимания, является потенциальная долгосрочная опасность, связанная с присутствием в препаратах примесей гетерогенных ДНК, особенно в тех случаях, когда последние могли содержать потенциально онкогенные кодирующие или регуляторные последовател ьности.
Однако, вероятность того, что ДН К из постоянных клеточных линий способна вызывать опухоли у людей, считается крайне низкой. Даже подкожное введение людям больших количеств клеток HeLa не сопровождалось канцерогенным действием. Анализ имеющихся экспериментальных данных показывает, что концентрация ДНК в культуральных жидкостях постоянных линий клеток гораздо ниже возможных трансформирующих уровней [14]. Совещание экспертов ВОЗ в Лондоне в 1989 г. определило, что предельное содержание гетерогенной ДНК (из клеточных систем и сконструированных векторов) в одной парентеральной дозе вакцин медицинского назначения не должно превышать 100 пкг. Подкожное введение 2 мкг ДНК вируса полиомы вызывает образование опухолей у 50% чувствительных животных. 100 пкг гетерогенной ДНК составляет 0,5х10'4 туморогенной дозы. Контаминирующая ДНК способна подавлять супрессорные гены или активировать протоонкогены после интеграции в клеточный геном. Риск мало зависит от происхождения контаминирующей ДНК. Все последовательности ДНК, обладающие характеристиками сильных промоторов, могут после рекомбинации создавать одинаковый риск. Вероятность присутствия опасной активности на 1 молекулу ДНК составляет 10'16—10~19. Особую опасность могут представлять мно- гокопийные плазмиды, амплифицированные сильные промоторные последовательности. Белковые контаминанты с коротким сроком жизни представляют меньший риск [788]. Таким образом, принято считать, что риск, связанный с примесью гетерогенной клеточной ДНК, ничтожен, если ее количество не превышает 100 пкг в одной дозе препарата, вводимого парентерально. При оральном применении вакцины этот риск еще более снижается [1684]. Агенты, применяемые для инактивации вирусов в вакцинах, могут снижать или устранять биологическую активность гетерогенной клеточной ДНК, повышая тем самым их безопасность даже в тех случаях, когда количество ДНК в дозе вакцины, вводимой парентерально, превышает 100 пкг [154]. Кроме того, современные методы очистки вирусных препаратов позволяют снизить содержание клеточной ДНК до уровня, при котором ее присутствие даже теоретически не представляет опасности. Высокая степень очистки от клеточной ДНК (10 пкг/мл) достигнута при изготовлении лимфобластоидного интерферона, вакцины против полиомиелита на клетках Vero и поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках СНО [14].
Риск, обусловленный вирусной контаминацией постоянных линий клеток, может быть связан с полными вирусами, механизм репликации которых известен, вирусными частицами, напоминающими ретро-вирусы типа А, а также вирусными генами, интегрированными в ДНК таких клеток. При использовании постоянных клеточных линий для снижения или устранения риска вирусной контаминации следует, прежде всего, применять систему посевных клеток.
Создание резервных запасов постоянных линий клеток, проверенных в соответствии с требованиями ВОЗ (1982, 1987 гг.), является необходимым условием производства лицензированных вакцин. Предполагаемый риск, связанный с белками, кодируемыми онкогенами постоянных линий клеток, ограничен лишь факторами роста, действие которых транзисторно и обратимо. В обнаруживаемых концентрациях они не представляют серьезной опасности и, кроме того, многие из них быстро разрушаются [ 154].
Методы контроля должны гарантировать отсутствие в конечном препарате биологически активных количеств потенциально онкогенных примесей (гетерогенная ДНК, трансформирующие белки, эндогенные вирусы). Исследовательские группы, рассматривавшие проблему приготовления медицинских иммунобиологических препаратов, пришли к заключению, что несмотря на существование потенциального риска, данные, подтверждающие безопасность препаратов, оправдывают их применение [154].
В 1985 г. Комитетом экспертов по стандартизации биологических препаратов были приняты «Требования к непрерывным линиям клеток, используемым в производстве биологических продуктов». Отмена запрета на использование постоянных клеточных линий в качестве субстрата в производстве медицинских биологических препаратов открыла новые возможности в деле расширения производства вирусных препаратов, повышения их качества и снижения стоимости.
В настоящее время в ряде стран широко используют постоянные линии клеток для изготовления медицинских биопрепаратов. Использование постоянных линий клеток в качестве субстрата в производстве вирусных вакцин имеет ряд преимуществ. Они не требуют сложных условий культивирования, их можно выращивать в промышленных культиваторах и ферментерах, хорошо изучить и охарактеризовать, а маточные расплодки, свободные от контаминации эндогенными и экзогенными вирусами, длительно хранить при низкой температуре. Многие ученые считают, что приготовление вакцин с использованием клеток Vero по сравнению с первичными культурами клеток почек обезьян, представляет меньший риск вирусной контаминации. Накапливается все больше данных, что клетки Vero и ВНК-21 - безопасные субстраты для производства медицинских биопрепаратов. Клетки Vero не обладали туморогенными свойствами, а клетки ВНК-21 (клон 13) оставались кариологически стабильными в течение 52 пассажей. Изучение чистоты и биологической безопасности белка клеток показало отсутствие посторонних вирусов, а также следов вирусных последовательностей в геноме клеток Vero. Клетки Vero используют в производстве вакцин против полиомиелита и бешенства человека. Инактивированная полиовакцина
улучшенного качества лицензирована в 1982 г., в последующие 5 лет ею было привито более 20 млн. детей без побочного эффекта. В 1988 г. ее производство составило 60 млн. доз. Инактивированная вакцина против бешенства лицензирована в 1985 г. В последующий период были использованы сотни тысяч доз вакцины при низком уровне клинических реакций. Успешно завершились широкомасштабные клинические испытания живой полиовакцины для орального применения из вируса, размноженного в клетках Vero.
В 1987 г. во Франции лицензирована компонентная вакцина против гепатита В, изготавливаемая на основе рекомбинантной линии клеток СНО. В Великобритании, Японии и Китае получали интерферон в культуре постоянной линии клеток Namalva.
В связи с возможностью клинического применения моноклональных антител [154], актуальность приобретает культивирование таких клеток в больших масштабах. Предварительные результаты [72] показывают, что непрерывное крупномасштабное культивирование гибридом в свободной суспензионной культуре в сочетании с непрерывным диализом культуральной среды может дать хороший урожай секретируемых антител (100—140 мг/л). При крупномасштабном производстве один работающий 1000-литровый ферментер фирмы Celltech может обеспечить получение килограммовых количеств моноклональных антител [254]. Кроме того, гибридные клеточные линии сами по себе могут быть использованы в качестве субстрата для репродукции вирусов.
Таким образом, только пересмотр существующих ограничений по применению тканевых культуральных систем для производства вирусных вакцин позволяет использовать индустриальные методы массового выращивания вирусов на основе суспензионного культивирования - подобно тому, как это делают в микробиологической промышленности. Ученых, работающих в этой области, не обескураживают даже очевидные успехи генной инженерии. Многие ученые считают, что генная инженерия с использованием микроорганизмов может упразднить проблемы, связанные с развитием и использованием массового культивирования клеток животных, и поэтому технология, основанная на их применении, не имеет будущего. Однако в конкуренции традиционной и новой технологий изготовления вирусных препаратов, где решающее значение имеет качество конечного продукта, обнаружились непредвиденные обстоятельства. Во-первых, при попытке экспрессии вирусных генов в прокариотических организмах не всегда получены удовлетворительные практические результаты. Во- вторых, с тех пор как стало возможным клонировать в клетках животных гены, кодирующие вирусные белки, важность крупномасштабного производства клеточных культур еще более возросла. Данные обстоятельства позволили выразить надежду, что биотехнология клеток животных сохранит свою авангардную роль