Существенным недостатком клеточных культур, осложняющим их применение, особенно в производстве живых вакцин, является опасность их загрязнения вирусами, бактериями, грибами, дрожжами, микоплазмами и паразитами. При крупносерийном производстве вирусных препаратов загрязнение клеточных культур различными микроорганизмами может встречаться относительно часто. Наиболее трудно выделить контаминацию латентными вирусами, которые длительное время могут оставаться незамеченными в культуре. Своеобразным видом контаминации является загрязнение клеток одной линии клетками другой. С тех пор как появились культуральные вирусные вакцины, проблемы их изготовления и контроля рассматривались индивидуально и решались по мере выявления.
Обычная практика приготовления культуральных вакцин связана с получением клеточных культур и размножением в них в достаточном количестве вируса. Гарантия чистоты конечного продукта — использование чистых материалов. Материалами, используемыми при производстве вирусных вакцин, с которыми связаны случайные эндогенные загрязнения, являются: исходный клеточный материал, сыворотка, питательная среда, трипсин и посевной вирус. Большинство из них заранее можно проверить на чистоту.
При использовании линий клеток в производстве вирусных препаратов их чистота и безопасность применения также могут быть определены заранее. Труднее контролировать клеточный материал, используемый при изготовлении пер
вичных культур, когда нет времени для оценки чистоты тканевого сырья. Несмотря на возможность длительного хранения свежеизолированных клеток в замороженном состоянии, этим приемом обычно не пользуются при изготовлении первичных культур.
Загрязнение бактериями, дрожжами и грибами. Несмотря на применение антибиотиков, бактериальные загрязнения встречаются в большинстве лабораторий. При исследовании 73 клеточных культур из 22 лабораторий наличие бактерий обнаружено в 20 (27%). Среди них идентифицированы коринебактерии, микрококки, бациллы и кишечная палочка. Они не вызывали помутнения культуральной жидкости и не оказывали ЦПД на клетки. Поэтому их обнаружение с использованием специальных методов было неожиданным для исследователей и показало, что контаминация клеточных культур на самом деле широко распространена. Псевдомонады и фекальный щелочеобразователь, в отличие от эшерихий и стафилококков, подобно вирусам могут образовывать «бляшки» в культуре. Некоторые дрожжи, как и бактерии, могут расти медленно и не оказывать цитопатического эффекта, особенно в присутствии антибиотиков. Плесени растут медленно и во многих случаях могут быть подавлены фунгизоном или нистатином.
С целью уменьшения воздушного загрязнения питательных сред, растворов и культур клеток применяют стерилизацию воздуха.
Стабильные линии клеток при длительном субкультивировании в обычных условиях, как правило, оказываются загрязненными микоплазмами. Основной источник такого загрязнения — сыворотка. В противоположность перевиваемым культурам, для первичных культур загрязнение микоплазмами — весьма редкое явление. В клеточных линиях обнаруживают различные виды микоплазм, которые могут накапливаться в высокой концентрации (gt; 106—107 КОЕ/мл). Контаминация микоплазмами не всегда сопровождается заметными изменениями роста культуры. Микоплазмы клеточных культур в основном относятся к четырем видам: М. orale, М. hyorhinis, М. arginini и М. laidlawii. При контроле живых вакцин следует иметь в виду возможность присутствия вариантов М. hyorhinis, не растущих в бесклеточной среде. Микоплазмы-контаминанты клеточных культур эффективно (98%) выделяли в коммерческой среде FC с предпочтительным выращиванием в анаэробных условиях. Деконтаминация постоянных линий клеток от микоплазм — весьма трудная задача и крайняя мера, применение которой оправдано лишь при невозможности возврата к неконтаминированной маточной культуре. Многочисленные попытки в этом направлении оканчивались безрезультатно. Обнадеживающие результаты получены при обработке клеток в течение трех недель антибиотиками (тиамулин 10 мкг/мл или моноциклин 5 мкг/мл) с последующим клонированием. После деконтаминации клетки в течение длительного периода наблюдения (75 пассажей) оставались свободными от микоплазм. Клетки удавалось освободить от микоплазм при одновременной
обработке моноциюшном, антисывороткой И КОМЩЩВД
клеток в течение шести дней с 0,4 мкг/мл квинолона микоплазмы исчезли. Ана
логичные результаты получены от одновременного применения спектриноми- цина (10 мкг/мл) и линкомицина (20 мкг/мл). Для деконтаминации от микоплазм предложено пассировать клетки на бестимусных мышах. Линию эритро- лейкемических клеток человека (К-562) удалось освободить от быстрорастущих в анаэробных условиях М. fermentas однократным введением мышам с последующим рекультивированием клеток in vitro.
Культуральные вакцины исследуются на наличие бактерий и грибов на жидких, а также плотных питательных средах в аэробных условиях. Микоплазмы выявляются культуральными и некультуральными методами.
Вирусная контаминация. Проблема контаминации клеточных культур различными вирусами возникла с момента применения культур клеток для производства вирусных вакцин. Источником случайных вирусных агентов в вирусных вакцинах могут быть инфицированные доноры ткани, а также материалы и условия культивирования (сыворотка, трипсин, загрязнения в процессе производства).
В настоящее время для производства живых вирусных вакцин против многих вирусных болезней широко применяют первичные культуры клеток различных животных. Однако первичные культуры клеток могут быть контаминированы различными посторонними вирусами, патогенность которых для человека и животных не всегда известна. Контаминация вирусами тканей и полученных из них культур клеток доказана практически для всех животных. Наиболее часто загрязненными оказывались культуры клеток почек обезьян. В тканях обезьян обнаружено более 50 вирусов, которые могут контаминировать клеточные культуры. Накопленный опыт показывает, что большинство вирусов, загрязняющих культуры клеток животных, оказались непатогенными для человека. Ряд вакцин (желтая лихорадка, корь, грипп) готовили с применением коммерческих куриных эмбрионов, содержащих вирусы лейкозосаркоматозного комплекса кур. Несмотря на длительное применение таких вакцин, не отмечено возрастание онкогенных заболеваний среди привитых [1303].
С целью уменьшения риска эндогенного загрязнения исходного клеточного материала различными вирусами и другими патогенными возбудителями для приготовления первичных культур часто используют ткани животных, выращенные в контролируемых условиях. Так, методом, гарантирующим чистоту живых эмбриональных вакцин в отношении вирусов лейкосаркоматозного комплекса птиц, является использование в производстве этих препаратов эмбрионов без- лейкозных линий кур. Хотя выращивание животных-доноров тканей в специальных питомниках ведет к значительному снижению количества вирусов-кон- таминантов, однако не решает проблемы контаминации в целом.
Клетки почек некоторых домашних животных являются хорошим субстратом для изготовления медицинских вирусных препаратов в связи с предположением, что они менее инфицированы вирусами, потенциально патогенными для человека, нежели ткани приматов, и потому еще, что указанные животные могут быть выращены в контролируемых условиях, при которых можно предотвратить контакт со многими вирусами.
В качестве примера можно привести вакцину против кори, вирус для которой выращивают в первичной культуре клеток куриных эмбрионов, получаемых от кур, свободных от вирусов лейкоза птиц. Для этой цели используют также первичную культуру клеток почек собак, выращенных в контролируемых условиях. Вакцину против краснухи готовят в культурах клеток почек собак и тканей эмбрионов уток.
Преимущество использования гетерологичных первичных культур (и, возможно, клеточных линий) для приготовления вирусных вакцин состоит не только в уменьшении риска, связанного с загрязнением патогенными микроорганизмами, но и оправдано с точки зрения предотвращения непредвиденного повышения реактогенности или реверсий вакцинного штамма в случае изготовления живых вакцин. Например, в медицине в течение многих лет готовят ряд вакцин с использованием куриных эмбрионов (КЭ), содержащих вирусы лейкоза птиц, однако за долгую историю применения этих препаратов для иммунизации людей не выявлено каких-либо неблагоприятных эффектов. Нет доказательств передачи людям болезней с препаратами, полученными с использованием культур клеток животных [ 154].
Контаминантами первичных культур клеток являются вирусы, обнаруживаемые у данного вида животных в естественных условиях. Существует прямая зависимость между частотой инфицированное™ животных данным вирусом и частотой его обнаружения в первичных культурах. Вирус диареи, широко циркулирующий среди крупного рогатого скота, часто обнаруживают в первичных культурах клеток этого вида животных, а также в качестве контаминанта некоторых вакцин. PC-вирус крупного рогатого скота часто удавалось обнаруживать в культурах клеток этого вида животных. В постоянной линии клеток почки свиньи при электронно-микроскопическом исследовании обнаружены эндогенные онкорнавирусы типа А, В и С, тога-, адено- и парамиксовирусы. В культуре клеток куриного эмбриона обнаружены рео- и аденовирусы.
Из клеточных культур вирусные контаминанты могут попасть в живые вирусные вакцины. Таким образом, например, вакцина против ньюкаслской болезни была загрязнена вирусом инфекционного бронхита кур, а вакцина против болезни Ауески — вирусом пограничной болезни овец.
Первичные культуры клеток животных проверяют на вирусную контаминацию, используя различные вирусологические, серологические, физические и молекулярно-биологические методы.
Теоретически все вирусы, встречающиеся у данного вида животных, могут загрязнять клеточные культуры, приготовленные из их тканей. Однако на основании практических наблюдений определены наиболее часто встречаемые вирусы, загрязняющие первичные клеточные культуры, а в итоге и культуральные вирусные препараты.
В таблице приведены наиболее вероятные вирусные контаминанты клеточных культур шести видов домашних животных.
Хотя получение исходного клеточного материала от животных, выращенных в контролируемых условиях, — шаг вперед, однако эта мера не является исчер
пывающей гарантией чистоты клеточного субстрата. Вирусная контаминация выявлена у многих линий клеток. Клетки ВНК-21 были контаминированы пар- вовирусом или короноподобным вирусом. Парвовирус обнаружен во многих клеточных линиях. Линия клеток почки поросенка (IBP-2) оказалась персистентно инфицированной авирулентным штаммом вируса классической чумы свиней, который попал в первичную культуру, вероятно, с клетками ранее вакцинированного животного-донора клеток для культивирования. Различные линии клеток почек свиней оказались инфицированными онкорнавирусом типа С. Частицы онкорнавирусов типа С и В были обнаружены также во многих линиях клеток человека и животных [66]. Практически в каждой постоянной линии клеток можно обнаружить эндогенные ретровирусы или ретровирусоподобные частицы. Однако экспрессия их генетической информации зависит от типа клеток. Потенциальная опасность таких вирусов связана с их сходством с онкогенными ретровирусами. Оценка экспрессии ретровирусов — трудная задача, требующая комплексного решения. В постоянной линии клеток яичника китайского хомяка с встроенным фрагментом ДНК, кодирующим HBs-антиген вируса гепатита В (CHO/HBsAg), обнаружено небольшое количество эндогенных ретровирусо-по- добных частиц типа С при отсутствии их биологической активности. Постоянная линия клеток, полученная из злокачественной лимфомы свиньи, продуцировала ретровирус свиней. В основе системы контроля постоянной линии клеток, исключающей случайную контаминацию при изготовлении вирусных вакцин, лежит создание банка хорошо проконтролированных клеточных линий
Таблица 9. Наиболее вероятные эндогенные вирусные контаминанты первичных культур клеток домашних животных

Происхождение клеток
крупный рогатый скот	свиньи	куры	собаки	овцы	кошки
вирус парагриппа-3	вирус классической чумы свиней	вирус ньюкаслской болезни	вирус чумы плотоядных	вирус парагриппа-3	вирус панлейкопении кошек
реовирус-1	реовирус-1	вирус инфекционного бронхита птиц	вирус инфекционного гепатита собак	реовирус-1	реовирус-1
вирус рино- трахеита	аденовирус	вирус лейкоза птиц	герпес-вирус	вирус катаральной лихорадки	пикорна- вирус кошек
вирус диареи	вирус болезни Ауески	вирус энцефаломиелита птиц	реовирус-1	вирус пограничной болезни	синцитиальный вирус кошек
аденовирус	парвовирус	CELO-вирус	аденовирус	лентивирусы овец	вирус лейкемии и саркомы кошек

и расплодок клеток, используемых в производственных целях в течение не более 20 пассажей. Все линии клеток проверяют на бактериальные, грибковые и вирусные загрязнения.
Известно, что сыворотка крови животных является потенциальным источником вирусной контаминации. Особенно хорошо изучена контаминация сыворотки крови крупного рогатого скота. Вирусы довольно часто обнаруживали в сыворотке крови эмбрионов телят и взрослого скота. Наиболее частые контами- нанты сыворотки — микоплазмы и вирус диареи крупного рогатого скота.
По этой причине линии клеток различного происхождения оказались хронически инфицированными вирусом диареи крупного рогатого скота. В их числе были перевиваемые клетки крупного рогатого скота (линии MDBK, GBK, BKD, ВК4 и др.), лошадей, свиней, овец, кроликов, кошек и обезьян. Методом иммунофлюоресценции установлено инфицирование вирусом диареи крупного рогатого скота многих культур клеток американской коллекции, полученных от крупного рогатого скота, свиней, обезьян, кошки и москитов. Различные первичные культуры и постоянные линии клеток в некоторых случаях оказались контаминированы полиомавирусом, источником которого была сыворотка инфицированного крупного рогатого скота. У людей, тесно контактировавших с таким скотом, обнаружены специфические антитела.
Вновь приготовленные серии сыворотки крупного рогатого скота обычно контролируют на отсутствие вирусного загрязнения в первичных культурах клеток куриных эмбрионов, почек телят и культуре клеток HeLa. Кроме исследования под микроскопом, культуры проверяют на гемадсорбирующие свойства с эритроцитами человека, кур и морских свинок. С целью повышения эффективности проверки коммерческих партий сыворотки на наличие микоплазмы рекомендована предварительная инкубация проб перед высевом на элективную среду. Образцы сыворотки центрифугировали при 100000 g, осадокресуспендирова- ли в небольшом объеме среды и вносили в культуры клеток, а также исследовали под электронным микроскопом. Наиболее часто контаминированной оказалась сыворотка крупного рогатого скота (13%). Значительно реже микоплазмы обнаруживают в партиях сыворотки овец (3,2%) и эмбрионов коров (3,1%). Для стерилизации сыворотки предложена специальная ультрафиолетовая обработка, а также инактивация бетапропиолактоном, которые не ухудшают ее ростовых свойств [1444]. Положительные результаты получены при стерилизации сыворотки перуксусной кислотой. Прогревание сыворотки при температуре 56 °С в течение 30 мин может служить эффективной мерой инактивации микоплазм и некоторых вирусов, присутствующих в ней в качестве контаминантов. Однако при этом снижаются ростовые свойства сыворотки.
Профилактика контаминации сыворотки заключается в тщательном отборе сыворотки и облучении ее гамма-лучами при — 40°С в дозе 2,5—3,5 мегарад. Гамма-облучение эффективно инактивирует и микоплазмы, причем при использовании 10% облученной сыворотки в питательной среде не отмечается нежелательного воздействия на рост клеток или их чувствительность к вирусам. Для со
хранения ростовых факторов эмбриональной сыворотки применяют специальные приемы, к числу которых относится сохранение сыворотки в замороженном состоянии до облучения, во время него и после него. Причиной контаминации клеточных культур парвовирусом свиней явились коммерческие партии трипсина Дифко. Сухой трипсин можно деконтаминировать гамма-облучением без потери его протеолитической активности.
В связи с возможностью латентного инфицирования клеточных линий патогенными вирусами, представляющими большую потенциальную опасность, в США введены ограничения на ввоз культивируемых клеток (особенно гибридов). Прежде всего, имеется в виду возможность заноса в страну вируса ящура, источником которого может служить сыворотка, применяемая при культивировании клеток.