Бешенство — остропротекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. Оно относится к числу наиболее опасных заболеваний человека и животных, которое регистрируется на пяти континентах. Вирус передается главным образом со слюной при укусах.
После размножения в экстраневральных тканях он вскоре достигает спинальных ганглиев и головного мозга, где реплицируется только в определенных группах нейронов. Заболевание, как правило, завершается летальным исходом.
Основную роль в иммунитете у вакцинированных против бешенства играют ВНА, направленные против G белка, который вызывает выраженный В клеточный ответ. Нейтрализующие IgG появляются на 6-8 дни после вакцинации. ВНА достигают титра 1:16— 1:32 на 9-12 дни, а максимального уровня через 3 недели и сохраняются более 6 месяцев. После переболевания у лошадей, КРС и свиней антитела могут сохраняться более 7 лет. Т-клеточный иммунный ответ сохраняется в течение длительного периода 1577].
Несмотря на высокую антигенность белков вируса бешенства, его размножение в инкубационный период заболевания, т.е. в период продвижения вируса от места внедрения до центральной нервной системы, практически остается безответным со стороны иммунной системы организма. Вероятно, в этот период очень мало вирусного антигена достигает иммунной системы, так как основная масса его задерживается в мышечных клетках или в нервных аксонах. Однако ранние стадии инфекции чувствительны к антителам, поэтому эффективна классическая пастеровская вакцинация, особенно в сочетании с применением гипериммунного глобулина. Иммунологическое вмешательство является эффективным в течение первого этапа длительного инкубационного периода между началом репликации вируса в мышечных клетках и проникновением вируса в защищаемое окружение нервной системы.
Блестящим примером применения живой антирабической вакцины для человека явилась вакцина Ферми [664]. Эту вакцину готовили из суспензии мозга овец или коз, инфицированных фиксированным штаммом вируса бешенства. Вирус частично инактивировали добавлением небольшого количества фенола. В дальнейшем для размножения фиксированного штамма вируса использовали мозг зараженных кроликов, новорожденных мышей, а также утиные эмбрионы и культуры клеток (первичные культуры клеток почек новорожденных хомяков, собак, поросят, телят, фибробласты эмбрионов кур; диплоидные клетки обезьян; линию клеток Vero). С использованием различных систем для пассирования и размножения получены разные варианты фиксированного штамма вируса бешенства (CVS, ERA, SAD, PM, HEP, LEP, Kelev, Kissling, Внуково 32). Поданным ВОЗ (1992 г.), культуральные вакцины для иммунизации людей являются безопасными и более иммуногенными, чем вакцины из нервной ткани. С целью исключения возможных осложнений по причине использования живого вируса в вакцине для человека, вакцинный вирус стали полностью инактивировать фенолом, формалином или (3- пропиолакгоном. В дальнейшем аналогичная рекомендация сделана в отношении вакцин против бешенства животных.
Вакцины, применяемые для профилактики бешенства животных (преимущественно собак и кошек), принципиально не отличаются от вакцин, применяемых людям. Отличие заключается в том, что в ряде стран по экономическим соображениям для иммунизации животных используют живые вакцины из безо
пасных аттенуированных штаммов вируса бешенства. Для иммунизации собак и кошек в основном применяют инактивированные комбинированные вакцины против нескольких заболеваний [1217].
Современные инактивированные культуральные вакцины и иммуноглобулин против бешенства являются основой борьбы с бешенством людей. Специфическая профилактика бешенства у животных основана на применении безопасных и эффективных живых и инактивированных вакцин [1329]. Хотя антира- бические вакцины начали применять еще в 1885 г., однако до сих пор остается нерешенным ряд проблем, касающихся профилактики бешенства и борьбы с ним среди животных. Вакцинация векторных домашних и диких животных направлена в первую очередь на охрану здоровья человека. Антирабические вакцины особенно нужны в районах, где бешенство является эндемическим заболеванием диких и домашних плотоядных. Основным резервуаром вируса бешенства в природе являются собаки, лисицы, еноты, скунсы и летучие мыши.
В мире ежегодно более 4 млн людей подвергаются вакцинопрофилактике и около 50000 погибают преимущественно от покусов инфицированными собаками. Специфическая профилактика бешенства людей в основном приходится на Африку, Азию и Южную Америку [ 1329].
В европейских странах, где преобладает лесной цикл передачи этой болезни, с 1981 г. зарегистрированы единичные случаи смерти среди людей [147]. В странах Южной Америки для иммунизации собак широко применяли вакцину из фиксированного штамма вируса, размноженного в культуре клеток мозга мышей-сосунов. Там ежегодно производили до 20 млн доз такой вакцины. Систематическое ее применение на протяжении 10 лет в ряде стран привело к резкому снижению случаев бешенства среди собак [147]. По данным ВОЗ, при массовой вакцинации в 1992 г. было привито 36 млн собак (в основном в Америке). Количество собак, подлежащих вакцинации против бешенства в мире, может достичь 500 млн.
Специфическую профилактику необходимо проводить не только среди собак, но в ряде регионов и среди сельскохозяйственных животных. В Бразилии, например, ежегодные потери крупного рогатого скота от бешенства составляют 30 000 голов [93], что свидетельствует о широких масштабах циркуляции вируса у векторных животных.
В настоящее время для специфической профилактики бешенства применяют инактивированные и живые вакцины. В медицине используют только инактивированные, слабоаллергенные или безаллергенные вакцины. Они в основном различаются по способу размножения вируса, концентрации и степени очистки вирусного антигена. Вирус размножают в культуре диплоидных клеток человека или в культуре клеток эмбриона птиц, или в культуре клеток почки обезьян. В качестве адъюванта применяют ГОА. Однако наиболее перспективным субстратом для производства медицинской вакцины оказались клетки Vero, которые обеспечивают более высокий выход вирусного антигена, чем первичные или диплоидные культуры клеток человека или животных. Клетки Vero можно выращивать на микроносителях, получая клеточные популяции высокой плот
ности. Культивирование этих клеток в ферментах большой емкости обеспечивает возможность крупномасштабного промышленного производства вакцины, что снижает ее стоимость. При изготовлении вакцины для человека на клетках Vero путем соответствующей очистки снижают до приемлемого уровня содержание ДНК клеточного происхождения [1340].
Аналогичным образом готовят вакцину для животных, используя различные клеточные субстраты, в том числе ВНК-21, обеспечивающие высокое накопление вирусного антигена [394]. Для изготовления инактивированной вакцины для животных вирус выращивают в культуре клеток ВНК-21, в том числе суспензионным методом с использованием ферментов, что позволило значительно снизить стоимость вакцины.
Систематически вакцинация собак и крупного рогатого скота значительно уменьшает случаи бешенства у животных и предотвращает заражение от них человека. Для иммунизации животных применяли живые и инактивированные вакцины. Живые вакцины из аттенуированных штаммов ERA, SAD, Flury и Roxane защищали 100% вакцинированных животных в течение не менее одного года. В Латинской Америке широкомасштабную вакцинацию собак проводили с использованием разных вакцин. Сейчас для иммунизации животных рекомендовано применять культуральную инактивированную адъювантную вакцину. Хорошие результаты получены при иммунизации диких плотоядных, в том числе диких собак, с помощью вакцины из вируса, размноженного в клетках ВНК-21 на микроносителе [141].
При изготовлении живых вакцин чаще всего использовали культуру клеток ВНК-21, в которой вакцинные штаммы накапливаются в титре 6,5—7,0 lg ТЦД50/мл. Два штамма фиксированного вируса бешенства были адаптированы к культурам клеток Vfero и ВНК-21 [421]. Живые вакцины были высокоэффективны и полностью безопасны [355]. Даже после интрацеребральных пассажей на собаках реверсии вирулентных свойств не отмечено. Безвредность штамма Flury-HEP/BHK-21 подтверждена в опытах на 207 диких животных 15 видов, обитающих в Европе. Антиген вакцинного штамма обнаружили в центральной нервной системе методом иммунофлуоресценции у 9,7% животных через 100 дней после прививки. Слабая репликация вируса в центральной нервной системе обнаружена у небольшой части (11,6%) животных. Живая вакцина из штамма SAD/BHK-21 (7,3 lg ТЦД50/мл) оказалась безвредной при введении собакам, кошкам и лисицам. Через семь дней после вакцинации вирус обнаружен в миндалинах у 2 из 36 лисиц и в подчелюстных железах некоторых кошек. После однократной вакцинации выраженную се реконверсию отмечали у 75% собак и 71% лисиц [494]. Живой вакциной ERA прививали крупный рогатый скот в Южной Америке. Испытания, проводимые в экспериментальных и практических условиях, показали эффективность живых вакцин при парентеральном и оральном способах иммунизации домашних и диких плотоядных животных [355, 494],
Живые вакцины при оральной иммунизации диких плотоядных в естественных условиях оказались незаменимыми. Установлена полная безопасность и эф
фективность оральной вакцинации лисиц живой вакциной из штамма SAD В- 19, адаптированного к культуре клеток ВНК-21 [394].
В 1978 г. в Швейцарии было начато крупномасштабное испытание живой оральной вакцины. В различных районах страны на площади 2277 км2 было распределено более 82 ООО приманок (куриных голов), содержащих живой вакцинный вирус. В феврале и октябре каждого года раскладывали примерно по 20 приманок на 1 км2. Антитела выработались примерно у 50% лисиц. В ряде районов распространение бешенства было приостановлено, а в некоторых это заболевание вообще исчезло. Не отмечено ни одного случая бешенства среди диких и домашних животных, который можно было бы отнести за счет применения вакцины [113]. Аналогичные данные получены при оральной иммунизации лисиц в Германии. Установлено, что 78% лисиц поедали приманки с вакциной (25 приманок на 1 км2). У 63% лисиц в крови обнаружены нейтрализующие антитела к вирусу бешенства. В результате наблюдали снижение случаев бешенства или даже его ликвидацию на обширных территориях [1661]. Опыты, проведенные в Швейцарии и Германии, показали, что положительные результаты могут быть получены при иммунизации не менее 50% лисиц [113, 1661 ]. Приманка должна содержать не менее 7,0 lg ИД вакцинного вируса [1661]. Опыт Швейцарии показывает, что иммунизацией популяции лисиц в районах возможного распространения бешенства удается поддерживать состояние благополучия. Повторная вакцинация во всех неблагополучных областях страны дает возможность ликвидировать бешенство в зараженных районах. Подобные результаты контроля «лесного» бешенства с помощью оральной вакцинации лис получены в ряде других стран.
В Европе и Северной Америке ведется работа по вакцинации диких животных против бешенства. Два основных типа вакцин используют в настоящее время для вакцинации диких животных: живые вирусные вакцины и живые рекомбинированные вакцины для орального применения. Все используемые живые вакцины происходят из оригинального штамма SAD. Четыре из них (ERA, SAD- Bern, SAD-B19 и Внуково-32) патогенны для взрослых мышей при введении в мозг, мышцы и орально. SAG-вакцина из делеционного мутанта штамма SAD (потеря аргинина в 333 положении) патогенна только для новорожденных мышей при интроцеребральном и оральном введении.
Для оральной иммунизации диких плотоядных, кроме традиционных живых вакцин, предложены реплицирующиеся рекомбинантные вакцины с использованием вируса осповакцины в качестве вектора гена G гликопротеина вируса бешенства.
Для оральной иммунизации лисиц использовали рекомбинантный вирус осповакцины (WTGgR АВ). В качестве приманки использовали куриные головы, содержащие 8,0 lg БОЕ рекомбинантного вируса. Иммунизация лисиц таким способом сопровождалась образованием высокого титра ВН-антител и обеспечивала их устойчивость к контрольному заражению [356] в течение 18 мес. [1215]. Аналогичные результаты получены на енотах при оральном и парентеральном методах введения рекомбинантного вируса осповакцины бешенства.
С 1990 г. рекомбинантная вакцина на основе вируса осповакцины в виде приманки из рыбной муки широко применялась в Бельгии и Франции. В Канаде с 1980 г. аналогичным образом иммунизируют красных лис живой вакциной ERA — ВНК. Отмечено наличие иммунитета у 74% лис. Для контроля бешенства диких животных в Европе и Северной Америке используют рекомбинантную вакцину VRG, которая содержала ген гликопротеина штамма ERA в тимидинки- назном гене вируса осповакцины. В дозе 108 ТЦД50 вакцина вызывала образование ВНА и выраженную защиту. Вакцина VRG не патогенна для 19 видов птиц и 35 видов млекопитающих. В 1988—1990 гг. 1 млн доз вакцины (приманок) было распределено на территории Бельгии и Франции [1217]. Вакцина VRG обладала выраженной эпизоотологической эффективностью при испытании в полевых условиях в Бельгии, Франции и США [577].
Хотя живые вакцины нашли широкое применение в ветеринарии, в настоящее время отмечается тенденция отдавать предпочтение инактивированным вакцинным препаратам, обладающим большой эффективностью и легкостью применения. С профилактической целью прививают сельскохозяйственных животных, наиболее часто поражаемых бешенством. Инактивированные вакцины лучше поддаются стандартизации. Минимальная антигенная доза составляет 0,3—1 ME. Если их применяют с адъювантом, они создают иммунитет такой же продолжительности, как и живые вакцины. Благодаря получению высокоактивного культурального вирусного сырья и концентрированию вирусных антигенов инактивированные вакцины последнего поколения стали превосходить живые антирабические вакцины. Например, получены вакцины с повышенной антигенностью, равной 3—5 ME в 1 дозе [355].
Антигенную активность живой (аттенуированный штамм ERA) и инактивированной вакцин сравнивали по титру ВН-антител на крупном рогатом скоте.
Вирус инактивировали БПЛ и добавляли ГОА и сапонии в качестве адъюванта. Живую вакцину вводили внутримышечго однократно в дозе 2 мл. У привитых однократно инактивированной вакциной титр ВН-антител через 6 и 10 мес. был выше, чем у привитых живой вакциной. Наиболее выраженная и продолжительная иммунологическая реакция отмечена в группе животных, привитых дважды инактивированной вакциной [1275].
Фирма Мерье (Франция) изготовила и сравнила три варианта инактивированной вакцины: лиофилизированную без адъюванта (в основном для собак и кошек), жидкую с ГОА и сапонином (для жвачных и свиней) и жидкую только с ГОА (для пушных зверей). Концентрация вирусного антигена в вакцине в 10 раз превосходила минимально требуемый уровень. Испытание всех вариантов вакцины на лабораторных животных, собаках, кошках, крупном рогатом скоте, овцах, свиньях и лошадях показало, что в результате иммунизации у животных всех видов создается прочный иммунитет длительностью 1,5—3 года. Ее можно использовать в комбинации с противоящурной вакциной у крупного рогатого скота и свиней, противочумной и лептоспирозной — у собак и вакциной против панлейкопении у кошек [ 1270].
Молодняк от вакцинированных матерей необходимо прививать с 3-месячного возраста. Вакцина сохраняла свою активность в течение трех лет при 5°С. Вакцина, хранившаяся 3 года, вызывала устойчивость к заражению вирулентным вирусом у 100% овец и кошек, а также у 97,4% собак. При заражении уличным вирусом двукратно вакцинированного крупного рогатого скота защита составляла 90—100%. Прививка КРС и овец смесью вакцин против бешенства и ящура давала такой же эффект, как и моновалентный препарат против бешенства. Для молодняка, родившегося от вакцинированных животных, необходима бустер-вакцинация в первые 12 мес.
Однократная вакцинация сопровождалась развитием иммунологической памяти, которая сохранялась не менее 16 мес. Устойчивость к заражению сочеталась с высоким титром ВН-антител [354]. Вакцина из очищенного вируса, размножаемого в клетках Vero, после двукратного применения с интервалом 12 мес. вызывала напряженный иммунитет продолжительностью до пяти лет [1359].
Пастеровский штамм вируса бешенства, выращенный в культуре клеток ВНК-21, инактивировали ДЭИ в щелочной среде. К одной части вакцины добавляли А1(ОН)3, другую использовали без адъюванта. Вакцину вводили крупному рогатому скоту подкожно в дозе 5 мл.
Через 1—2 года после прививки вакциной с адъювантом все животные были устойчивы к контрольному заражению, а через 3 года — 92%. Вакцина без адъюванта через 1 год защищала лишь 67% животных. Вакцина с адъювантом сохраняла иммуногенность при 4°С в течение 24 мес., при 25°С — 18 мес., при 37°С — 6 мес. [927].
Штамм HEP-S AD (6,9—8,0 lg ТЦД50/мл) хорошо размножался в культуре псевдодиплоидной линии (NL-ST-1) клеток тестикул свиней. Моно- и комбинированные вакцины (против бешенства, ринотрахеита кошек, калицивируса кошек и панлейкемии) создавали у кошек напряженный иммунитет продолжительностью не менее 1 года.
Для изготовления инактивированной вакцины против бешенства приемлема технология, используемая при производстве противоящурной вакцины в ряде развитых стран на основе суспензионного культивирования клеток ВНК-21 [927].
Ведутся исследования по разработке рекомбинированных вакцин на основе нереплицирующихся векторов, экспрессирующих G белок вируса бешенства. Наиболее перспективным считается получение антигенного материала на основе векторов вирусов оспы птиц, абортивно реплицирующихся в культуре клеток млекопитающих. Такие рекомбинанты синтезируют на поверхности инфицированных клеток гликопротеин G вируса бешенства без образования потомства инфекционного вируса. Были созданы рекомбинанты вируса бешенства и вирусов оспы птиц и оспы канареек, которые экспрессировали гликопротеин G вируса бешенства под контролем промоторов вирусов оспы. Такие рекомбинанты индуцировали ВНА к вирусу бешенства у 6 видов млекопитающих (мыши, крысы, кролики, собаки, кошки и КРС). Иммунитет у всех вакцинированных (108 ТЦД50) мышей, собак и кошек установлен методом заражения высоковиру
лентным вирусом бешенства через 3 месяца после вакцинации. Полная защита у кошек и собак наступала после введения небольшой дозы вакцины, равной 105 ТЦД50. ИмД50 для кошек и собак соответственно была равна 3,3 и 4,19 lg ТЦД50. Такие рекомбинантные вакцины оказались неэффективными при оральном применении [1503].
Профилактика бешенства у инфицированных людей заключается в применении гипериммунного глобулина и курса вакцинации. Иммунный глобулин против бешенства обычно применяют в дозе 20 UE/кг массы тела, половину вводят вокруг места укуса, половину — внутримышечно. В США и многих развитых странах используют две лицензированные адъювантные вакцины из вируса, размноженного в культуре диплоидных клеток (HDCV вакцина) и первичной культуре клеток почки обезьян резус (RVA вакцина). Вакцину в дозе 1 мл вводят внутримышечно в дельтоидную область 5 раз в следующие дни — 0, 3, 7, 14 и 28; если пациент был вакцинирован ранее, то иммунный глобулин не используют, а применяют двукратную вакцинацию в 0 и 3 дни. Эти режимы специфической профилактики сводят на нет смертность от бешенства [ 1135].
Для лиц высокого риска рекомендованы три внутримышечные дозы культуральной вакцины с иммуногенной активностью не менее 2,5 IU в одной дозе, введенной в 0, 7 и 28 дней. Иммунитет у привитых контролируют каждые 6 месяцев по титру ВНА. Бустеризацию проводят при снижении титра ВНА ниже 0,5 IU/мл. С лечебной целью используют культуральные вакцины или очищенные вакцины из вируса, размноженного в эмбрионах уток.
Иммунизация стандартными антирабическими вакцинами защищает человека и животных от заражения разными вирусами, родственными вирусу бешенства, но не вирусом Мокола [113].