Название семейства (от греч. orthos — правильный, туха — слизь) предложено в связи с родством его представителей к муцину.
Семейство ортомиксовирусы содержит 4 рода: вирусы гриппа А, В и С и то- готовирусы. Вирусы гриппа А, В и С можно различить по антигенности нуклео- капсидных (NP) и матриксных (М) белков. Вирусы гриппа А подразделяются на субтипы на основе антигенной структуры и их гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Эти антигены весьма изменчивы, например, в настоящее время у вирусов гриппа А птиц известно 15 вариантов антигена НА и 9
вариантов антигена NA. Число возможных вариантов этих двух антигенов может достигать 135. Другими отличительными признаками вирусов гриппа А, В и С является их природный хозяинный спектр. Вирусы гриппа А в естественных условиях широко распространены среди птиц, людей и ряда других видов млекопитающих, включая свиней и лошадей. Неосложненный грипп у людей, лошадей или свиней характеризуется интенсивной репликацией вируса в эпителиальных клетках респираторных путей, воспалением и внезапным проявлением общей и респираторной болезни. Вирусы гриппа В инфицируют только людей. Вирусы гриппа С были выделены в основном от людей, реже — от свиней и не вызывали серьезных нарушений. В отличие от вирусов гриппа А и В, они не обладают нейраминидазной активностью и содержат не два, а один гликопротеин — белок слияния (гемагглютинин — эстераза, HEF). Вирусы гриппа А и В содержат по 8 РНК-сегментов, а вирус гриппа С — 7 (отсутствует ген NA). Вирулентность и антигенная изменчивость вирусов гриппа А, В и С снижаются в алфавитном порядке их обозначения [1024].
Тоготовирусы переносятся клещами и размножаются в клещах и млекопитающих.
Типичный представитель ортомиксовирусов — вирус гриппа типа А. Он имеет сферическую форму, диаметр вирионов 80—120 нм. В препаратах свежевыделенных штаммов обнаруживают преимущественно нитевидные формы длиной до 4 мкм. Высказано предположение, что филаментозные формы являются мультигеномными образованиями [94].
Вирионы ортомиксовирусов состоят из фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеиновой оболочки, представляющей собой центральнорасположенный двойной липидный слой, окруженный снаружи и изнутри белками. Белки наружного слоя образуют пепломеры длиной 10—12 нм. Вирионы содержат около 1—2% РНК, 70% белка, 20% липидов, 5—8% углеводов. Липиды оболочки происходят из липидов плазматической мембраны клеток. Вирионы гриппа А и В морфологически неразличимы друг от друга, тогда как вирионы гриппа С отличаются от других представителей семейства тем, что их поверхностные пепломеры организованы в шестигранные фигуры. Вирусные штаммы вирусов гриппа А и В, выделенные от человека или животных и размноженные в течение 1 пассажа в культуре клеток, обнаруживают высокую гетерогенность и плеоморфизм. Морфологические характеристики вируса гриппа А носят генетический след, а также зависят от типа клеток, в котором они размножены. Лабораторные штаммы вирусов гриппа А и В, размноженные в КЭ или культурах клеток, приобретают вид сферических частиц и могут изменяться антигенно в результате мутации в ГА (замена трех аминокислот в ГА). Вирус, размноженный в КЭ или в культуре клеток, защищает против культурального вируса более эффективно, чем против вируса, выделенного от человека [1154, 1664].
В составе вирусов гриппа А обнаружено семь полипептидов с молекулярной массой 21—96 кД. Два гликопротеина (НА и NA) образуют наружный слой оболочки: один негликозилированный белок (М) — внутренний слой оболочки; че
тыре белка входят в состав нуклеокапсида. Пепломеры вирусов гриппа А и В, представляющие наружный белковый слой вириона, образованы двумя гликопротеинами — гемагглютинином (НА) и нейраминидазой (NA). Пепломеры ге- магглютинина образованы тремя молекулами белка (210—240 кД), пепломеры нейраминидазы образованы четырьмя молекулами белка (250 кД). В свою очередь каждая молекула НА состоит из двух субъединиц (НА1 - 45-450 кД, НА2 — 30-35 кД).
Большинство вирионов гриппа А покрыто слоем примерно из 500 пепломе- ров, радиально обрамляющих вирионы и выступающих на 10-14 нм над поверхностью липидной оболочки. Различают пепломеры двух видов: палочкообразные — НА и грибообразные — NA. Соотношение НА и NA обычно равно 4:1—5:1. Вирусы гриппа А, В и С кодируют также другой интегральный белок — соответственно М2, NB и СМ2. Матриксный белок (Mj) тесно примыкает к двойному липидному слою и связан рибонуклеопротеиновой сердцевиной вируса. Mj является наиболее массовым вирионным белком.
РНП состоит из 4 видов белка и РНК. Нуклеопротеин представлен преимущественно белковыми субъединицами, покрывающими РНК: около 20 нуклеотидов приходится на 1 субъединицу НП. Связанный с РНП РНК-зависимый РНК-полимеразный комплекс состоит из трех полимеразных белков РВ1, РВ2 и РА, которые содержатся в количестве 30—60 копий на вирион. РНК вирусов гриппа в РНП остается чувствительным к РНК-азе, чем отличается от РНК в РНП вирусов парагриппа.
Сегменты генома вируса гриппа А кодируют следующие белки: сегмент 1 кодирует белок РВ2; сегмент 2 — РВ1; сегмент 3 — РА; сегмент 4 — НА; сегмент 5 — NP; сегмент 6 — NA; сегмент 7 — М( и М2; сегмент 8 — NS, и NS2 [919].
Участок связывания с клеточным рецептором представляет собой трехмерную структуру в виде складки на поверхности НА у верхнего конца шипа в субъединице НА1. Белок НА синтезируется изначально как молекула из 566 аминокислот, которая затем претерпевает ряд изменений. Важным моментом в процессинге является протеолитическое расщепление НА с образованием двух субъединиц НА1 и НА2. Образовавшийся димер НА1 — НА2 стабилизируется с помощью а-спиральных участков и солевых мостиков, расположенных в стебле. Расщепление НА с образованием двух цепей сопровождается конформационны- ми изменениями белка и изменениями его антигенных и других свойств, в частности способствует проявлению фузионной активности.
Вблизи С-конца НА вируса гриппа выявлена гидрофобная область, содержащая около 25 аминокислот, которая погружена в билипидный слой. 10 аминокислот на С-конце НА проникают в нуклеокапсид вириона из билипидного слоя. Пять из последних высококонсервативны и играют важную роль в функционировании НА. Участок, проникающий из билипидного слоя внутрь вириона, служит местом прикрепления жирных кислот.
В энзиматически активном тетрамере NA можно выделить четыре домена. Цитоплазматический домен необычен среди трансмембранных гликопротеинов
тем, что представлен N-концевой аминокислотной последовательностью всего лишь из шести аминокислот. Трансмембранный домен представлен неконсервативной последовательностью приблизительно из 28 гидрофобных аминокислот. Основная часть нейраминидазы выступает над поверхностью вириона и состоит из двух доменов: короткого спирального стебля возле мембраны и большой глобулярной головки, лежащей на расстоянии от поверхности вириона. Каталитический участок этого белка расположен возле поверхности глобулярного домена. Типичная NA имеет четыре сайта гликозилирования, расположенных в «стебле». NA разрушает клеточные рецепторы, освобождая таким образом вирусное потомство с поверхности клетки, и препятствует самоагрегации вирионов. NA также облегчает прохождение вируса сквозь муцин при естественной инфекции. Вирулентность вируса гриппа определяется последовательностью основных аминокислот в сайтах протеолитического расщепления гемагглютинина, т.е. его первичной и вторичной структурой [1233].
Вирулентные штаммы вируса гриппа, в отличие от невирулентных, обязательно активизируются за счет расщепления протеазами. Гемагглютинины вируса гриппа расщепляются внутриклеточно и потому способны инфицировать клетки различных тканей и вызывать системную инфекцию [1450]. Ортомиксо- вирусы с нерасщепленным НА имеют низкую инфекционную активность. Инфекционная форма вируса с расщепленным НА в организме млекопитающих образуется только в клетках, выстилающих дыхательный тракт [1624]. При отсутствии трипсина в культуре клеток расщепляется НА только вирулентных штаммов вируса [875]. Для вируса гриппа птиц установлена строгая корреляция между расщепляемостью НА, способностью размножаться в культуре клеток и патогенностью для кур. Расщепление НА на субъединицы не является обязательным для сборки и выхода вирионов из клетки и проявления гемагглютинирующей активности. Полагают, что фактором, детерминирующим патогенность вируса гриппа птиц, является чувствительность НА к протеолитическому расщеплению.
В сайте расщепления НА у вирулентных штаммов содержится несколько основных аминокислот, а у невирулентных — только один остаток аргинина. Таким образом, только участок из нескольких основных аминокислот у С-конца НА образует сайт узнавания для ферментов, ответственных за расщепление [875, 1624].
Основные функции НА: гемагглютинирующая активность вируса; прикрепление вирионов к клеткам-мишеням путем связывания с сиалосодержащими рецепторами; слияние вирусной и клеточной мембран. НА является основным специфическим антигеном вируса, определяющим (наряду с NA) подтип и вызывающим образование антител, нейтрализующих инфекционность вируса и его ГА-активность. НА играет главную роль в индукции протективного иммунитета при гриппе. В молекуле НА имеются 3—4 антигенных домена, изменения в которых определяют антигенный дрейф [81]. NA является ферментом, катализирующим отщепление сиаловой кислоты от субстрата. Удаление сиаловой кислоты с НА облегчает его расщепление клеточными протеазами. Антитела к белку NA
имеют вспомогательное значение в защите и нейтрализуют вирус лишь при высоком титре. Матриксный белок М — самый низкомолекулярный структурный белок. Он принимает участие в морфогенезе вириона и стабилизации его структуры. Нуклеопротеид (NP) — основной внутренний белок, формирующий субъединицы капсида. Белки NP и М являются типоспецифическими антигенами, общими для всех вирусов гриппа одного типа, и в этом отношении резко отличаются от высокодивергентных поверхностных белков [1132]. Они не вызывают образования протективных антител. Однако нуклеопротеин вируса гриппа — основной антиген, узнаваемый цитотоксическими Т-лимфоцитами. Аминокислотные последовательности 260—283 нуклеопротеина вируса гриппа А являются индукторами Т-клеточного ответа [694]. Изменение антигенных свойств вируса гриппа — результат двух генетических процессов: антигенных дрейфа и шифта. Антигенный дрейф происходит в основном через накопление аминокислотных замен (точечных мутаций) в НА1. Замена одного аминокислотного остатка в эпитопе нарушает его связывание с соответствующими МАТ. Основные механизмы антигенного шифта — реассортация отдельных генов, возвращение в популяцию старых генов, прямые мутации, изменяющие специфичность к хозяину. NA может измениться независимо от НА. Вариабельность НА вируса гриппа А значительно выше вариабельности НА вируса гриппа В.
В процессе адаптации вируса гриппа к различным системам наблюдают изменение антигенной структуры НА, в основе которой лежит селекция мутантов с измененной рецепторсвязывающей специфичностью. Вирусы гриппа А и В человека, размноженные в КЭ, могут изменяться антигенно и претерпевать мутации в ГА (замена трех аминокислот в ГА). Вирус, размноженный в КЭ или в культуре клеток, защищает против культурального вируса более эффективно, чем против полевого вируса, выделенного от человека [1154, 1664].
Один и тот же клинический изолят вируса гриппа при размножении в культуре клеток животных (МДСК) или в КЭ имеет разные антигенные свойства, что связано с заменой одной-двух аминокислот в разных участках молекулы НА. Особенно заметные изменения антигенности в молекуле НА наблюдали при замене аминокислотных остатков 187 и 189 в процессе адаптации вируса к КЭ [1312]. Изменение сайта гликозилирования может сопровождаться изменением антигенности и вирулентности вируса. Состав углеводов гемагглютинина вирусов и гриппа птиц может изменяться в различных хозяйских клетках даже в течение одного пассажа. У вирусов гриппа птиц типа А идентифицировано девять нейраминидазных N-антигенов, обозначенных 1—9, и 13 гемагглютинирующих антигенов Н, обозначенных 1-13. Состав Н- и N-антигенов полевых изолятов зависит от вида птиц, места и времени вспышек гриппа. Свиньи восприимчивы к различным подтипам вируса гриппа А и, возможно, вместе с водоплавающей птицей являются главным резервуаром вируса гриппа в природе.
В пермиссивных клетках вирусный НА активируется путем расщепления на две части НА1 и НА2, которые остаются связанными дисульфидными связями. Вирионы прикрепляются к клеткам, активированным НА, соединяются с рецеп
торами сиаловой кислоты плазматической мембраны и входят в клетку эндоци- тозом. После сплавления оболочки вируса и эндоплазматической мембраны транскрипционный комплекс освобождается и транспортируется в ядро, где происходит транскрипция и репликация РНК.
Так же, как у всех других вирусов с негативно-полярным РНК-геномом, геном ортомиксовирусов выполняет две функции: 1) матричную для синтеза мРНК и 2) матричную для синтеза позитивно-полярной промежуточной формы РНК, которая служит матрицей для синтеза потомства геномной РНК. Из 8 первичных транскриптов, синтезированных на 8 генных сегментах вирусов гриппа А и В, 6 являются моноцисторными и транслируются прямо в белки. Два других — подвергаются сплайсингу с образованием двух мРНК, которые транслируются с различных рамок считывания с образованием двух белков. Вирусные белки синтезируются, используя клеточный механизм трансляции. Ортомиксови- русы используют несколько механизмов для увеличения кодирующей способности: сплайсинг мРНК, спаренную стоп-старт-трансляцию тандемных генов и сдвиг рамки считывания.
Репликация геномных РНК сегментов требует синтеза полноразмерных, положительной полярности РНК посредников, которые, в отличие от соответствующих мРНК транскриптов, не имеют КЭП-структуры на 5'-конце и поли (А) последовательности на З'-конце. Вновь синтезированный нуклеопротеин присоединяется к этим РНК, облегчая их использование в качестве матрицы для синтеза геномной РНК. Вирионы формируются почкованием, включая М белок и нуклеокапсид, которые встроены на плазматической мембране, в которую включены НА и NA. Механизмы копирования каждого РНК сегмента и включение их в каждый вирион неизвестны [919].
Хотя в результате реассортации генов теоретически могут возникать вирусы с любой комбинацией Н и N генов, однако только ограниченное число вирусов с определенной комбинацией Н и N генов оказались важными патогенами, имеющими право на существование. В том числе вызывающие респираторную патологию у людей: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1 и, возможно, H3N8; у лошадей H7N7 и H3N8; у норок H10N4; у котиков H7N7 и H4N5; вирусы, часто выделяемые от свиней - H1N1 и H3N2. Главными возбудителями гриппа птиц являются вирусы с H5N2 и H7N1, хотя встречаются и другие варианты вируса гриппа А. Так как установлена резистентность диких видов птиц к вирусу гриппа А, им отводили роль резервуара вируса, прежде всего для домашней птицы. При экспериментальном заражении вирусом H1N5 дикие утки, как правило, не проявляли клинических признаков болезни, хотя вирус в их организме размножался и выделялся во внешнюю среду. Латентное инфицирование вирусом гриппа может иметь место у других домашних и диких животных.
С целью специфической профилактики гриппа человека и животных предложены различные вакцины. В практике борьбы с гриппом человека широко применяли три вида инактивированных вакцин [189]: вирионные, представляющие собой взвесь цельных вирионов; расщепленные - взвесь структурных ком
понентов после разрушения детергентами; субъединичные вакцины, содержащие только протективные антигены — гемагглютинин и нейраминидазу.
Многие коммерческие вакцины фактически относят к смешанному типу, поскольку они содержат и цельные вирионы, и их структурные компоненты. Промышленным способом получают две вирионные вакцины, различающиеся способом очистки и концентрирования вируса: с использованием для этой цели методов хроматографии и центрифугирования.
Результаты испытания инактивированных вакцин против гриппа человека весьма разноречивы. Если оценивать по уровню индукции гуморального иммунитета, то наиболее иммуногенны высокоочищенные цельновирионные концентрированные инактивированные вакцины.
К основным недостаткам цельновирионных инактивированных вакцин, применяемых в медицине, относится определенная реактогенность, связанная с примесными компонентами аллантоисной жидкости куриных эмбрионов и внутренними антигенами вириона (М- и NP-белки). Субъединичные вакцины оказались слабоантигенными [145].
Инактивированные вакцины по сравнению с живыми вызывают более выраженное образование гуморальных антител, но значительно слабее стимулируют развитие местного иммунитета. По этой причине многие исследователи отдают предпочтение применению живых вакцин против гриппа, полагая, что они значительнодешевле и вызывают как гуморальный, так и местный (клеточный и секреторный) иммунитет. Живые вакцины наиболее пригодны для иммунизации детей, у которых нет антител, способных нейтрализовать вакцинный вирус.
При введении вакцинированным добровольцам вирулентного вируса живая вакцина защищала от заболевания всех, а инактивированная — только 72% привитых. Приживление вирулентного штамма вируса после контрольного заражения обнаружено у 13% лиц, привитых живой, и у 63% - инактивированной вакциной.
Гуморальные и секреторные антитела обнаружены соответственно у 94 и 38% привитых инактивированной вакциной и у 59 и 82% - живой. При заражении людей гомологичным вирулентным вирусом через 6 мес. после иммунизации живой и инактивированной вакцинами защитный эффект отмечен соответственно в 91 и 75% случаев.
Установлено, что в иммунитете при гриппе важная роль принадлежит стимуляции Т-лимфоцитам, распознающим вирусспецифические белки на поверхности инфицированных клеток. Установлено, что белок М-2 вируса гриппа обнаруживают на поверхности инфицированных клеток, этот белок является наиболее консервативным белком, характерным для всех вирусов гриппа. Учитывая, что этот белок может быть главной мишенью для перекрестно реагирующих ци- тотоксических Т-клеток, сконструирована рекомбинантная вакцина против вирусов гриппа и гепатита В.
В последнее время большое внимание уделяют разработке и оценке живых рекомбинантных вакцин, полученных на основе вирусов гриппа А птиц и человека. Вирусы гриппа А птиц использовали в качестве доноров аттенуации.
От вируса гриппа А человека брали гены, кодирующие гемагглютинин и ней- раминидазу. Такие рекомбинанты обнаружили удовлетворительную степень аттенуации, генетическую стабильность и выраженную иммуногенность, они не размножались в нижних отделах респираторного тракта обезьян и птиц. Реас- сортантный штамм не обладал энтеротропизмом и в опытах на обезьянах не передавался горизонтально. Аттенуированный фенотип сохранялся в течение пяти серийных пассажей на обезьянах.
Реассортантные холодоадаптированные вакцины, разработанные в бывшем СССР и США, оказались безопасными, генетически стабильными и высокоэффективными. Одновременное введение вакцин H1N1 и H3N2, полученных в процессе реассортации разных эпидемических вирусов с одним и тем же донором аттенуации, не сопровождалось интерференцией и в то же время обеспечивало образование антител и защиту от обоих типов вируса. Такие вакцины обладают выраженной эффективностью для детей. Для защиты взрослых людей необходимо использовать иммунизацию живой, а затем инактивированной вакцинами [42].
А. А. Смородинцев и сотрудники [178] разработали способ сочетанной вакцинации людей живой и инактивированной вакцинами, при котором происходит одновременная стимуляция местного и общего клеточного и гуморального иммунитета. Высокая иммунологическая реактивность при сочетанной иммунизации всегда соответствовала высокому защитному эффекту. Иммунизация серонегативных людей вначале живой вакциной, а затем нереплицирующимися антигенами в сочетании с иммуностимуляторами, вероятно, является наиболее эффективным способом профилактики гриппа.
Резервуаром вирусов гриппа А являются водоплавающие птицы, особенно утки, у которых вирус размножается в эпителии кишечника и экскретируется в высокой концентрации с фекалиями. Мигрирующие водоплавающие птицы переносят вирус на большие расстояния, что может играть ключевую роль в эволюции вируса. Периодически происходит обмен вирусными генами или вирусами между разными видами: домашней птицей, особенно утками и млекопитающими, такими как свиньи, лошади, норки и человек. Вирусы гриппа патогенны для животных, но очень редко становятся зоонотичными, т.е. прямо от животных передаются человеку.
Все вирусы гриппа млекопитающих, возможно, произошли от вирусов, циркулирующих среди водоплавающих птиц. Вирусы, передаваемые млекопитающим и птицам от диких водоплавающих птиц, послужили причиной вспышек заболевания в последние годы. Однако в экспериментальных условиях вирусы, полученные от одних видов животных, нереплицируются у других видов. Например, вирусы гриппа человека не размножаются у уток и лошадей, а вирусы гриппа птиц не размножаются у человека и других приматов. Это показывает, что размножение вирусов ограничивается кругом хозяев. Главная роль в этом процессе принадлежит гемагглютинину, а также наличию вируса на клетках хозяина [838].
В последнее время эпидемии гриппа были связаны с вирусами гриппа подтипа H1N1, H3N2 или вирусом гриппа В. С 1996 г. вирусы подтипов H7N7, H5N1 и
H9N2 были переданы от птиц человеку, но не смогли распространиться в популяции людей. Вирус гриппа птиц A H5N1 был выделен от ребенка, погибшего с патологией респираторных органов [670]. Такие события происходят редко. Реассортация вирусов человека и птиц может осуществляться в их общих хозяевах, в частности свиньях. Полагают, что последние участвуют в межвидовой передаче вирусов гриппа и таким образом в популяцию человека попадает вирус подтипа Н1N1 [233].
Грипп кур отмечен в США в 1983 и 1984 гг. [874]. Во второй половине прошлого века вспышки гриппа кур имели место в России [206]. Вспышка гриппа норок была зарегистрирована в Швеции примерно в тот же период. Возбудителем ее оказался вирус гриппа A H10N4. Случаи заболевания людей вирусом гриппа птиц A H5N1 в Гонконге поставили задачу защиты людей от вируса гриппа птиц [206].